misle.ru страница 1страница 2
скачать файл


На правах рукописи

КРЫЖАНОВСКАЯ ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА



БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА В ВЕТЕРИНАРИИ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Щелково - 2008 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и тех­нологическом институте биологической промышленности (ВНИТИБП), Кубан­ском государственном медицинском университете (г. Краснодар) совместно с ЗАО «Биопрогресс».

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор,

Албулов Алексей Иванович



Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Тихонов Игорь Владимирович

доктор ветеринарных наук, профессор Смоленский Владимир Иванович

доктор ветеринарных наук, профессор Балашов Владимир Михайлович



Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)

Защита состоится 26 декабря 2008 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности:

141142, Мо­сковская область, Щелковский р-н, п/о Кашинцево, пос. Биокомбината, ВНИТИБП; тел. /факс: 526-43-74; E-mail:vnitibp@mail.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан « » 2008г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д. Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Биологически активные вещества (БАВ), неспе­цифические средства, которые производятся из компонентов различного при­родного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, расте­ния и т.д.), используются в качестве подкормки для животных, птиц, насекомых и растений, оказывают стимулирующий иммунитет, антимик­робное, сорбционное, антиоксидантное воздействие, улучшают качество об­рабатываемого продукта и находят все более широкое применение в ветерина­рии.

Биологически активные вещества (БАВ), обладающие способностью воздействовать на иммунокомпетентные системы, делятся на экзогенные и эндогенные. Подавляющее большинство первых - это вещества микробного происхождения (бактериального и грибкового). БАВ эндогенного происхож­дения условно разделяют на две группы: иммунорегуляторные пептиды и цитокины. Пептиды представляют собой, в основном, экстракты из органов иммунной системы (тимуса, селезенки) или продукты их жизнедеятельности (костного мозга). Под цитокинами понимают всю совокупность биологиче­ски активных белков, продуцируемых лимфоцитами и макрофагами: интерлейкины, монокины и интерфероны.

Незаразные болезни молодняка сельскохозяйственных животных в первые дни жизни широко распространены в животноводстве и являются од­ной из основных проблем ветеринарной практики. Болезни молодняка сель­скохозяйственных животных имеют повсеместное распространение и их ле­чение, и профилактика являются неотложными задачами ветеринарии.

Из незаразных заболеваний молодняка наиболее часто регистрируют желудочно-кишечные болезни, которые составляют у молодняка до 10-дневного возраста 60-90%. Связано это, прежде всего с нарушением техноло­гии содержания и кормления животных, а также несовершенством естест­венной защиты их организма к воздействию неблагоприятных факторов

внешней среды. Желудочно-кишечные болезни телят наносят огромный ущерб животноводству вследствие высокой заболеваемости и падежа (до 100%), затрат на лечебные мероприятия, снижения продуктивных качеств и племенной ценности животных. Хотя изучение данной проблемы посвящено много работ, и для лечения этой группы заболеваний предложено много схем, все же до настоящего времени не удается достигнуть 100% сохранно­сти молодняка. Гительсон С.С. (1974), Ежиков А.А. (1970), Зароза В.Г. (1984) и др. (1984) установили, что наибольшее распространение среди болезней те­лят имеет диспепсия, заболеваемость которой на молочных фермах и ком­плексах составляет 80%-95%, а летальность от 15% до 70%. Причем, заболе­вание имеет сложную этиологию, что создает трудности в диагностике и ле­чении. При заболеваниях в ранний период жизни регистрируется высокая ле­тальность в связи с тем, что болезни чаще протекают на фоне иммунодефицитов.

Проблема иммунной недостаточности у молодняка сельскохозяйствен­ных животных выходит на первое место, особенно при переводе хозяйств на промышленную основу и создания комплексов с большой концентрацией по­головья животных на малой территории. Это способствует тому, что у жи­вотных создается недостаточный иммунный фон и возможно снижение на­пряженности иммунитета. Болезни органов пищеварения у молодняка, как правило, протекают на фоне пониженной резистентности организма. Поэто­му разработка новых препаратов и схем лечения желудочно-кишечных забо­леваний у молодняка, способствующих повышению неспецифической рези­стентности, является перспективным направлением.

В связи с вышеизложенным, проблема поиска новых биологически ак­тивных препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных забо­леваний молодняка весьма актуальна.

Хитозан в настоящее время используется в различных областях народ­ного хозяйства. Особого внимания заслуживает применение его в ветерина­рии и медицине. Установлено, что хитозан является слабым аллергеном, об-

ладает достаточно низкой токсичностью и пирогенностью (Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П., 2002; Быкова В.М., Немцев СВ., 2002; Allan G.G., Peyron M., 1989).

Хитозан способен образовывать гели в слабокислых растворах (рН 5-6). Кроме того, он может создавать пленку на коже и раневых поверхностях, а также на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, обладает высо­кой адсорбционной емкостью, способен выводить токсичные вещества, сти­мулирует клеточных и гуморальный иммунитет (Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Шинкарев СМ., Фролова М.А., 2001; Червинец В.М., Бондаренко В.М., Комаров Б.А., 2002; Muzarelli r.a.a., 1988). Эти свойства хитозана могут быть использованы для создания средств лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, приносящих большой экономический ущерб.

В зависимости от содержания в составе препарата фракций с различ­ными молекулярными массами хитозан может проявлять в той или иной сте­пени сорбционные, иммуномодулирующие, бактериостатические, фунгиста-тические, противовоспалительные и другие свойства (Ильин Л.А., Андриано­ва И.Е., Глушков В.А., 2003; Червинец В.М., Албулов А.И., Червинец Ю.В., 2006).

Туберкулез наносит значительный экономический ущерб животновод­ству страны, что связано с широкой распространенностью болезни, необхо­димостью убоя реагирующих на туберкулин животных в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах и населенных пунктах (Смолья-нинов Ю.И., Донченко А.С и др., 2005.). Поэтому поиск новых препаратов для антимикробной терапии туберкулеза и других заболеваний является на сегодняшний день актуальной задачей (Капков Л.Г., Smith J., Wood E., Domish M., 2004).

Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в по­следние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому при­менению этих природных полимеров во многих областях, в том числе вете-

ринарии и медицине. Это определило интерес к изучению молекулярного механизма действия липолитических ферментов и поиску соединений, влияющих на липидный обмен. Хитозан, благодаря уникальной структуре и положительному заряду, является полифункциональным соединением, обла­дающим целым рядом уникальных свойств: высокой совместимостью с жи­вотными тканями, биодеградируемостью, отсутствием токсичности и др., что определяет перспективы его использования в качестве ингибитора липолити­ческих ферментов (Sumiyoshi M., Mhurchu С).

Изучение биоактиоксидантов показало их существенную роль в под­держании уровня свободно радикальных реакций и регулировании обмена липидов в мембранах клетки. Важно, что существование системы регуляции было обнаружено практически для всех изученных внутриклеточных и кле­точных мембран клеток животных, растительных организмов и микроорга­низмов.

Важнейшим элементом поддержания здоровья животных а, значит, продуктиности и сохранности) являются доброкачественные корма, т.е. кор­ма, свободные от чужеродных вредных для организма веществ. Одни из са­мых опасных чужеродных примесей - микотоксины (ядовитые низкомолеку­лярные метаболиты плесневых микроскопических грибов). Даже следы микотоксинов в кормах (30-100 мкг/кг) приводят к потере продуктивности, снижению иммунитета и воспроизводительных функций. Особо актуальна проблема микотоксинов у тех видов, у которых основу рациона составляет зерно и продукты его переработки у птиц.

Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило пересмотреть многие методические подходы к во­просам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, воз­будителями которых является условно-патогенная микрофлора, и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных пре­паратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспече­нию биологической защиты животных (Сафонов Г.А., Калинина Т.А., Романова В.П., 1992; Панин А.Н., Серых Н.И., 1993; Сидоров М.А., Субботин В.В., 1988; Тихонов И.В., Гаврилов В.А., 2003).

На основании литературных данных известно, что к числу высокоэф­фективных лечебно-профилактических средств специалисты относят пробио-тики (Воронин Е.С., 1989; Панин А.Н., 2000; Fuller R., Gibson G., 2000 и др.). По мнению многих специалистов, основополагающим принципом при созда­нии пробиотиков является использование микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры животных (Бовкун Г.Ф., 1999; Сидоров М.А., 2000; Berg R., 1998 и др.).

Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза, такие как лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки. Использование пробиотиков в ветеринарии затрагивает довольно широкий круг проблем, начиная от коррекции кишеч­ного биоценоза и распространении на коррекцию иммунной, гормональной и ферментной систем молодняка животных (Вилыпанская Ф.Л., 1987; Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б., 1995; Грачева Н.М., Партий О.С, Ле­онтьева Н.И., 1996; Парфенов А.И., 1998; Малик Н.И., 2002).

Широкое применение в медицине и ветеринарии препаратов на основе лактобацилл и бифидобактерии при острых кишечных инфекциях и дисбак-териозах показало их эффективность и перспективность (Малик Н.И., 2000; Субботин В.В., и др., 2001).

Одной из первых отраслей сельского хозяйства, перешедших на про­мышленную основу производства, является птицеводство. Доля препаратов для птиц составляет 95% мирового рынка лечебных препаратов для живот­ных (более 7 млрд. долларов в стоимостном выражении).

В связи с этим все более актуальной становится проблема профилакти­ки, лечения и нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте, минимизации последствий антибиотикотерапии, повышения эффективности выращивания и сохранности птицы, улучшения качества конечного продукта. Один из способов ее решения - разработка и применение биологически активны веществ (БАВ) нового поколения, которые характеризуют высокой биодоступностью и положительно влияют на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта птицы, что приводит к оздоровлению всего организма в целом и снижению микробизма окружающей среды. К их числу относят эубиотики - пробиотики и пребиотики (Антипов В.А., 1991; Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., 2003; Данилевская Н.В., Субботин В.В., 2005).

Наиболее перспективным является создание симбиотиков - комплексов про- и пребиотиков.

Многие из симбиотиков влияют на гуморальный и клеточный иммуни­тет, зоотехнические показатели, могут служить естественными стимулятора­ми роста и обладать токсико- и радиопротективным действием, снижающим влияние неблагоприятных экологических факторов.

Продовольственная проблема, связанная с недостатком биологически полноценных продуктов, со временем не только не теряет своей остроты, но и становится одной из актуальнейших. Эффективность решения этой про­блемы определяется использованием качественно новых методов производ­ства продуктов питания, а также привлечением новых сбалансированных ис­точников пищевого белка, одним из которых является белок микроорганиз­мов. Работы многих ученых посвящены вопросам изучения возможности ис­пользования микроорганизмов как источников белковых веществ (Коновалов В.А., 1975; Беликов В.М., 1977; Шкляр Б.Х., 1977; Латов В.К., 1990; Римарева Л.В., 1993; Иванова Л.А., 1998; Неклюдов А.Д., 2000; и др.).

Наиболее перспективным источником пищевого белка является дрож­жевая биомасса, что объясняется полноценностью белковых веществ, амино­кислотный набор которых приближается к животному белку, а также безо­пасностью и абсолютным отсутствием токсичности дрожжей. Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рас­сматривать дрожжи как перспективные субстраты для получения биологиче­ски активных добавок.

Природные цеолиты обладают уникальными свойствами адсорбции, ионообменной, каталитической и детоксикационной способностью. Благода­ря своему кристаллохимическому строению цеолиты биохимически активны и кислотоустойчивы. Поэтому их применение в различных отраслях посто­янно расширяется.

В настоящее время животноводство и птицеводство в России испыты­вает большую потребность в кормовых белковых продуктах для своего раз­вития и становления. Особенный дефицит кормовых белковых продуктов стал заметно ощущаться в настоящее время, так как в 90-х годах были оста­новлены крупнотоннажные заводы БВК, производящие кормовые дрожжи на основе углеводородов «паприн» (Ермишина И.Г. и др., 2005). Кормовые бел­ковые продукты, полученные на основе микробиологического синтеза, по своему химическому составу и питательной ценности не уступают традици­онным белковым кормам, таким, как соевый шрот, мясокостная мука, рыбная мука и др.

Сложившаяся в мире ситуация с потреблением мяса и мясных продук­тов требует рационального использования сырья, повышения эффективности производства и улучшения качества готовой продукции. Для решения выше­указанных проблем необходимо разрабатывать и внедрять в производство новейшие методы обработки мяса с целью использования при производстве различных мясопродуктов не только высокосортного сырья, но и сырья, об­ладающего повышенной жесткостью и требующего длительной термообра­ботки (Рогова Н.В., Снегур Ф.М. и др., 2007)

При разработке методов обработки низкосортного сырья, содержащего большой процент соединительной ткани, необходимо учитывать, чтобы ме­тод не приводил к потере массы, не ухудшал органолептические свойства и технологические характеристики готового продукта и позволял интенсифи­цировать процесс производства мясопродуктов, отличающихся высокой пи­щевой и биологической ценностью.

Следовательно, исследования, теоретическое обоснование и разработ­ка новых биологически активных веществ (БАВ) для нужд ветеринарии яв­ляются актуальными.

1.2.Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований

- разработка теоретического обоснования и практического применения су­ществующих и разработка принципиально новых биологических веществ с использованием современных методов биотехнологии для нужд ветеринарии. Для решения цели исследований были поставлены следующие задачи:

1 .Теоретически обосновать использование БАВ в ветеринарной практике. 2.Исследовать влияние хитозана на механизм гомеостаза и гуморальную и неспецифическую защиту организма у животных.

3.Изучить антибактериальную активность хитозана к штаммам микобак-терий и, в частности, для профилактики и лечения туберкулеза.

4.Провести работы по активации хитозана для повышения его сорбцион-ных свойств при использовании в качестве кормовых добавок для КРС. 5.Исследовать антиметастическую активность олигомеров хитозана и его применение в сочетании с экстрактом противоонкологического фитосбо­ра.

6.Изучить антиоксидантную активность и ранозаживляющую способность хитозана при использовании на животных.

7.Обосновать использование коллагеназы, пробиотиков, синбиотиков для профилактики и лечения в ветеринарии.

8.Изучить возможность использования в качестве кормовых добавок и компонентов питательных сред цеолита, автолизата хлебопекарных дрожжей, яично-дрожжевого гидролизата для использования в различных отраслях сельского хозяйства.

9.Осуществить практическое использование рассмотрение БАВ в ветери­нарии.

10.Рассчитать предполагаемую экономическую эффективность от широ­кого применения исследованных БАВ в ветеринарии.



1.3. Научная новизна. Применение препаратов низкомолекулярного сукцината хитозана вызывает усиление функционирования механизмов го-меостаза у животных (телят), усиливает антителогенез и увеличивает титры циркулирующих в крови антител, а также активирует факторы, характери­зующие гуморальную и неспецифическую защиту организма.

Впервые экспериментально подтверждено, что хитозан обладает бакте-риостатическим и ранозаживляющим действием по отношению к патогенным возбудителям забо­леваний животных и птиц и при нанесении им химических и термических ожогов.

Впервые разработана методика активации хитозана, которая позволила получить сорбент с емкостью на 40-60% больше, чем у исходного полимера. Показано, что акцинат и сукцинат хитозана со степенью деацетилирования 87-97% и молекулярной массой 50-250 кДа обладает максимальной сорбционной емкостью (80-10 мг/г) и успешно испытан на животных и птицах.

Показано, что повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловливает ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нормой. Скармли­вание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана оказало ра-диопроекторное действие.

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6% у животных опытных групп по сравнению с контролем.

Антиметастатический синергизм действия в фитохитодезтерапии возмо­жен при сочетании олигомерной фракции хитозана с компонентами сложного состава экстракта противоонкологического фитосбора. Кроме этого, обнару­женный эффект может быть косвенным подтверждением наличия синергети-ческого антиоксидантного (и, по-видимому, поливакцинного) действия экс­трактов лекарственного сырья, особенно для многокомпонентных фитосбо­ров и при сочетании с полиэлектролитами природного происхождения.

Разработана технология получения фитохитодезов - биологически актив­ных добавок к пище, состоящих из сухих экстрактов сбора лекарственных растений и хитозана полифракционного состава в виде его водорастворимой формы.

Впервые в результате анализа полученных экспериментальных данных установлено, что использование ферментного препарата коллагеназы улучшает качественные характеристики готового продукта при внесении его в мясное сырье.

Впервые разработанный кормовой белок-добавка - синбиотик «Правита» по сравнению с другими кормовыми белковыми продуктами обладает более высокой питательной ценностью и биопротекторными свойствами в качестве кормовой добавки для птиц.

Результаты исследования кормовой биологической добавки (цео-лит+культура Echerichia coli VL 613) подтвердили ее эффективность взамен дорогого кристаллического лизина.

Разработанная кормовая добавка с использованием цеолита при добавлении в питательную среду была успешно использована при культивировании клеток перепелиных эмбрионов глубинным способом, позволила увеличить конечную концентрацию клеток.

Все изготовленные серии препарата для борьбы с личинками кровосо­сущих комаров Aedes aegipty с использованием культуры B.thusingiensis H-14 шт. 1501 и автолизата хлебопекарных дрожжей в качестве компонента пита­тельной среды по биологической активности соответствовали требованиям НТД и оказались эффективными.

Применение яично-дрожжевого гидролизата в качестве лечебно-профилактической добавки для подкормки пчел, обеспечивает профилактику заболевания пчел - нозематоза, компенсации белковой недостаточности и ус­корения процессов жизнедеятельности пчелиных семей.

Впервые установлено, что бактерии L.planturum, шт. М-30 и B.subtilis,

шт. В-1948, обладают достаточным уровнем антогонистической активно­стью к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. Кроме того, они обладают достаточным уровнем устойчивости к широкому кругу анти­биотиков, что позволяет сочетать антибиотическую и пробиотическую тера­пию в случае эпидемии в хозяйствах.

1.4. Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований были использованы при совершенствовании технологий производства хитозана, биопрепаратов, используемых для профилактики, лечения, а также повышения резистентности и продуктивности животных. Аттестовано производство и получено Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных. Зарегистрировано в Российской Федерации. Утверждено заместителем Руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосаниарному надзору Е.А.Непоклоновым 15 мая 2007г.
1.5. Апробация работы. Основные положения работы были представлены на следующих конференциях:

- Международной научно-практической конференции «Научные осно­вы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП,


Щелково, 2007г.;

- Ш Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству, Мо­сква, 2007г.



1.6. Основные положения и результаты, выносимые на защиту.

  1. Теоретическое обоснование и практическое использование хитозана для гуморальной и неспецифической защиты организма животных, по антибактериальной активности, сорбционных свойств, антиметастической активности и оксидантной активности для профилактики и лече­ния в ветеринарии.

  2. Использование ферментного препарата коллагеназы для улучшения ка­чественных характеристик мяса и мясных продуктов.

  3. Теоретическое обоснование и практическое применение пробиотиков, синбиотиков в сельском хозяйстве.

  4. Исследование и практическое применение различных кормовых доба­вок и компонентов питательных сред при выращивании бройлерных цыплят, препаратов против кровососущих, нематоза пчел, антибиотико- и пробиотикоскопию и повысить эффективность фитопрепаратов на основе хитозана в случае угрожающей ситуации в сельском хозяй­стве.

1.7. Публикации. По результатам диссертации опубликовано работ, в
том числе статей в научных журналах, докладов в сбор­никах научных конференций.

1.8. .Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изло­жены на 192 страницах машинописного текста и состоит из следующих

разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсужде-

ние полученных результатов, выводы и данные о практическом использова­нии научных выводов, список использованной литературы 348 источников, в

том числе 217 отечественных и 131 зарубежных. Работа содержит 18 таблиц, 9 рисунков, 52 страницы приложений.



2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена за период с 2000 по 2007 гг. во Всероссийском науч­но-исследовательском и технологическом институте биологической про­мышленности (РАСХН) совместно с центром «Биоинженерия» (РАН), ЗАО «Биопрогресс» (Щелково, Россия), Кубанским государственным медицин­ским университетом (г.Краснодар) ГосНИИСинтезбелок по программе «Со­ставить руководящие и информационно-справочные документы по обеспече­нию качества лекарственных средств для животных на этапах их разработки, апробации и производства в соответствии с Национальным Законодательст­вом и Международными Требованиями» (per. № ИС-01.200.2.08792) и в со­ответствии с планом НИР и ОКР ВНИТИБП отраслевых научных программ и Федеральной целевой научно-технической программы «Ветеринарное благо­получие (2001-2005 гг.).

Изучение влияния низкомолекулярного сукцината хитозана на иммунный ответ телят на фоне их плановой иммунизации против пастереллеза телят прово­дили в 2006 году на базе МТФ ООО «Автобан» в Краснодарском крае. Титр специ­фических антител определялся методом непрямого ИФА, а фракции хитозана разделялись мембранным методом. Исследования сывороток крови на содержа­ние иммуноглобулинов различных классов проводились методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в лаборатории иммунологии ВИЭВ под руководством члена корреспондента РАСХН Ю.Н.Федорова.

Опыты по определению антимикробного эффекта кислоторастворимого хи­тозана и выживаемости микобактерий проводили со следующими штаммами: типичными -Mycobacterium avium (штамм IEKBM УААН), Mycobacterium bovis и атипичными - M. fortuitum, M.smegmatis M. intracellulare предоставленными ННЦ «ИЗКВМ», Г. Харьков. Атипичные микобактерии, как и возбудители тубер­кулеза, вызывают сенсибилизацию к туберкулину крупного рогатого скота. Они широко распространены во внешней среде и попадая в организм, обуславлива­ют повышенную чувствительность к туберкулину у млекопитающих. Данные бактерии часто используют как тестовые при разработке дезинфицирующих пре­паратов при туберкулезе.

В работе использовали крабовые кислоторастворимые хитозаны с ММ 58 и 87 кДа, а также водорастворимые: сукцинат хитозана с молекулярной массой 380,0 кДа, и низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 38 кДа, произ­водства ЗАО "Биопрогресс" (Щелково, Россия).

Определение антиоксидантной активности осуществляли с помощью прибора для определения антиоксидантной активности лекарственных препа­ратов, продуктов питания и биологически активных веществ «Яуза AAA 01» на базе ОАО «НПР «Химавтоматика» по величине окислительно-восстановительного потенциала, определяемого амперометрическим титрова­нием. В качестве маркера для количественной оценки использовали дигидро-кверцитин.


Раневые покрытия готовили следующим образом: хитозан производства ЗАО «Биопрогресс» растворяли в 1% янтарной кислоте, добавляли масляный раствор анестезина, эмульгировали в присутствии лецитина, частично осаждали из раствора содой и сшивали янтарным ангидридом. Полученный гель высушивали на воздухе при 25-300С и получали пленки.

В качестве опытных животных использовали белых беспородных крыс с массой тела 180-200 г, которым под эфирным наркозом воспроизводили термический и химический ожоги на депилированной поверхности тела площадью 2 см.

В работе по изучению влияния ферментного препарата коллагеназы на мясопродукты препарат вводили в концентрациях 0,03%, 0,05% и 0,1% до стадии термообработки мясопродуктов.

Качество продукции оценивалось по следующим показателям: содер­жание влаги, содержание сухих веществ, содержание связанной влаги, потеря массы, общая органолептическая оценка.

Пребиотик «Авистим» для птиц приготовлен на основе культуральной жидкости высшего гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 -3 и исследована его антиоксидантная активность при защите птиц.

При разработке технологии получения лечебно-профилактических кор­мовых белковых добавок-синбиотиков для птиц использовалась биомасса

дрожжей-сахаромицетов, в которую добавлялась биомасса гриба Fusarium Sanbucinum МКГ-2001-3, пробиотики Bac.subtilis и молочнокислые бактерии.

Препарат под наименованием «Провит» был испытан на бройлерных цыплятах.

В качестве наполнителя кормовой биологической добавки для цыплят был использован цеолит Хотынецкого месторождения Орловской области в виде мелкозернистой крошки размером частиц до 1 мм и биомасса E.coli VL 613, синтезирующая одну из незаменимых аминокислот - лизин в ор­ганизме цыплят.
Для производства препарата для борьбы с личинками кровососущих ко­маров Aedes aegipty использовался автолизат энтопатогенной культуры Bacillus thuringiensis Н-14 штамм ИПМ-1501 содержащей эндотоксин. Выра­щивание культуры Bac.thuringiensis осуществлялась в биореакторе АНКУМ-2 емкостью 10 л на питательной среде, содержащей автолизат хлебопекарных дрожжей.

Четыре опытные серии яично-дрожжевого гидролизата и подкормки пчел в сухом и жидком виде исследованы по основным физико-химическим характеристикам и прошли испытания на пасеке учхоза «Леоновский» Мос­ковской области, совхозе «Малынь» Шекинского района, Тульской области и пчелосовхоза «Беканский» Северная Осетия.

Исследования in vitro антогонистической активности и чувствительно­сти к антибиотикам проводились по отношению бактерий L.plantarum,

шт.М-30, B.subtilis, шт.В-1975 и методом острогенного антагонизма в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов - S.tuphimurium, S.dublin, S.gallinfrum, 3- штаммов E.coli: К-88, К-99, А-20 и полевого изолята E.coli, выделенного от больной птицы. Об антогонистической активности штаммов судили по величине зоны задержки роста тест-культуры.

Для обеспечения качества и безопасности производства биологически активных веществ в биотехнологии необходимо соблюдать Международные правила GMP, требовании ИСО и анализа рисков БАССР.

Для анализа и статистической обработки экспериментальных данных использовались методы дискретного распределения, t-распределения Стью-дента, %2- распределения, корреляционный анализ, одно и многофакторная регрессия, критерий значимости и доверительные интервалы (Н.Джонсон, Ф.Лион «Статистика и планирование эксперимента в технике и науке. Мето­ды обработки данных. М.: Мир, 1980 - 611 с).




3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

З.1.Применение низкомолекулярного сукцинита хитозана в качестве им-муномодулятора при вакцинации телят против пастереллеза

Разработан способ мембранного разделения фракции (ультрафильтра­ция) низкомолекулряного хитозана, позволяющий получать полимер с задан­ной молекулярной массой. По сравнению с хроматографическими методами фракционирования ультрафильтрация дает возможность получать достаточно высокий выход продукта с более низкой себестоимостью.

Результаты исследования на токсичность фракций хитозана, полученных мембранным разделением по данной методике, представлены на рис.1.

Рис.1. Зависимость токсичности хитозана от молекулярной массы при внутрибрюшинном введении белым мышам


Анализ уровня антител в сыворотке крови подопытных животных по­казал, что при введении хитозана у телят наблюдалось увеличение титра спе­цифических антител, выявленных в непрямом ИФА, в сравнении с контро­лем. Средние титры антител у животных опытной и контрольной групп пред­ставлены в таблице 1.

Таблица 1

Средний титр антител при вакцинации телят против пастереллеза в сочетании с препаратом хитозана

Группы животных

Титры антител

Через 14 дней

Через 21 день

Через 60 дней

Опыт

1:700

1:1400

1:1700

Контроль

1:666

1:733

1:1200

Через 14 суток после вакцинации разница между титрами антител у животных опытной и контрольной групп составила 0,95%. Через 21-е сутки после вакцинации содержание антител у телят опытной группы прогрессивно возрастало на 52,63% по сравнению с контролем. На 60-й день после вакци­нации титры антител в обеих группах составляли 1:1700 и 1:1200 соответст­венно, т.е. у животных, вакцинированных совместно с хитозаном, титр анти­тел на 70% выше, чем у контрольных животных, которым этот препарат не вводили (рис.2)

Титр антител

дни

Фон 14 день 21 день 60 дней

Рис.2.Динамика титров антител в сыворотках крови КРС на фоне вакцинации совместно с хитозаном
Таким образом, на всех этапах исследования отмечена выраженная тенденция к повышению уровня выработки антител при применении хитозана по сравнению с контролем.
Результаты исследования сывороток крови на содержание иммуногло­булинов различных классов представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Содержание иммуноглобулинов отдельных изотипов в крови телят опытной и контрольной групп

Группы

IgG, мг/мл

Ig M, мг/мл

Ig А, мг/мл




Через 14 суток после вакцинации (т=5)




Опыт

20,50±1,73

2,73 ±0,28

0,24± 0,1

Контроль

20,30 ±1,36

2,47±0,14

0,22±0,01




Через 21 после вакцинации (п=5)Опыт




Опыт

21,14±2,01

3,35 ± 0,3

0,21 ±0,03

Контроль

21,36 ±0,54

3,32 ±0,54

0,23 ± 0,04

Изучение влияния хитозана на иммунобиологический статус молодня­ка КРС при вакцинации против пастереллеза показало, что применение дан­ного полимера в качестве иммуномодулятора обусловило индукцию развития долгосрочного иммунитета, повышенную выработку специфических антител и образование иммунного ответа на месте введения вакцины. Таким образом, выявлено наличие иммуномодулирующих и адъювантных свойств исполь­зуемого препарата хитозана при сочетанном его введении крупному рогато­му скоту с пастереллезной вакциной.

Приведенные исследования показали, что использование препаратов хитозана может вызвать оптимизацию механизмов гомеостаза у животных, усиливать антителогенез и увеличивать титры циркулирующих в крови анти-

тел.


Обобщая данные, полученные в результате проведенных эксперимен­тов, можно заключить, что введение хитозана 4-х месячным телятам одновре­менно с вакцинацией против пастереллеза обусловило:

-увеличение титра специфических антител в сравнении с контролем, выявленных в непрямом ИФА;

- предотвращение снижения уровня гемоглобина и повышение коэф­фициента метаболической активации нейтрофилов крови к 14 суткам после вакцинации;

-активацию механизмов, обеспечивающих поглощение чужеродного материала нейтрофилами к 21 суткам после вакцинации.



3.2 Антимикробный эффект влияния кислоторастворимого хитозана против возбудителей туберкулеза

В работе использовали крабовые низкомолекулярные водорастворимые хитозаны с молекулярной массой (ММ), равной 4;7;8;5;11;24 кДа и степенью деацетилирования (СД) 85%, N-сукцинил хитозан с ММ 396 кДа, и кислоторастворимые хитозаны с ММ 96, 177 и 380 кДа, полученные на базе ЗАО «Био­прогресс» (Щелково, Россия). Образцы низкомолекулярного хитозана были получены ферментным гидролизом с помощью хитонолитического комплек­са Streptomyces kurssanovi и из хитина восковой моли Colleria mallonella.

Для изучения чувствительности клеток к антимикробному действию хитозана готовили 0,025; 0,05; 0,75; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0 % растворы хитозана в питательной яичной среде, после чего коагулировали при температуре 90°С в течение 60 минут. Затем высевали 0,5 мл микробной суспензии на чашку Петри с питательной средой в присутствии хитозана или без хитозана (кон­троль). Посевы с клетками культивировали в течение 28 дней при температу­ре 37°С, учет роста культур на средах проводили каждые 7-10 дней.

Работу проводили с штаммами микобактерий Mycobacterium smegmatis шт 211 (предоставлен лабораторией «Биотехнология стероидов», Центра «Биоинженерия» РАН), штаммы Mycobacterium avium (штамм Vailee) пре­доставлены ННЦ «ИЭКВМ), г. Харьков.

Зависимость процента гибели микобактерий от ММ хитозана приведе­на в таблице 3 и на рис.3.

Таблица 3

Влияние кислоторастворимого хитозана с различной ММ на гибель микобактерий M.smegmatis при экспозиции в течение 1 часа,




t=37°C и рН=6,8 ед.рН





№пп

ММ, кДа

X=lgx

Y % гибели микобактерий

1.

4

0,60

80

2.

7

0,84

77

3.

8,5

0,93

75

4.

11

1,04

68

5.

24

1,38

57

6.

96

1,98

37

7.

177

2,25

18

8.

396

2,60

4

Оценка зависимости процента гибели бактерий от кислоторастворимо­го хитозана с различной ММ и времени экспозиции проводились методами регрессионного и корреляционного анализа.

Предварительные исследования и аналитические соотношения позво­ляли считать % гибели микробных клеток линейной функцией от логарифма молекулярной массы (ММ) хитозана. При этом регрессионная задача сводит­ся к оценке параметров в уравнении



где Х – lgx (молекулярная масса хитозана) (1)

Y - % гибели клеток

Y,%

100


80

60

40



20


х

0 24 96 177 396 х, ММ, кДа

Рис. 3. Зависимость процента гибели микобактерий M.smegmatis

молекулярной массы хитозана через 1 час при t=37°C и рН- 6,8 ед.рН
График зависимости % гибели микобактерий от ММ хитозана представлен на рис. 4.


Yo%
100
80
60
40
20

0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 lgх



Рис.4 . Линеризованная зависимость % гибели микобактерий от lg (MM) хитозана согласно уравнения (4).


Коэффициент корреляции R рассчитывался из уравнения вида: (2)

R= 0,9


Данные значения R свидетельствуют о тесной линейной связи между % гибели микобактерий и ММ кислоторастворимого хитозана, который осо­бенно эффективен при низких значениях ММ = 4,7,8,5,11.

Первоначально опыты по определению выживаемости микобактерий были проведены на атипичном тестовом штамме M.smegmatis.bGieTKH M.smegraatic инкубировали с хитозаном краба с ММ-4-396 кДа и хитозаном восковой моли с ММ от 7-177 кДа в концентрациях 0,1% при температуре


370 С, на качалке. После этого пробы титровали и высевали на чашки Петри. В качестве контроля использовали клетки, не обработанные хитозаном. По истечении 72 часов инкубации определяли количество жизнеспособных кле­ток (КОЕ).

Из рис.3 следует, что процент гибели клеток М. smegmatis после 60 мин экспозиции при 37°С и рН 6,8 оставлял 0-76% в зависимости от ММ ис­пытанных хитозанов. Наименьшей чувствительностью клетки обладали к вы­сокомолекулярным образцам хитозана с ММ 96 и 177 кДа. Высокомолеку­лярный крабовый хитозан с ММ 396 кДа в концентрации 0,1 % не обладал антибактерийным действием. Максимальной активностью в отношении кле­ток микобактерий обладали низкомолекулярные хитозаны с ММ 4-8,5 кДа.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что хитозан обладает бактериостатическим действием по отношению к возбудителю туберкулеза ви­дов M.bovis и М. avium, что указывает на перспективность дальнейших исследо­ваний с целью применения его для лечения и профилактики туберкулеза сель­скохозяйственных животных и птиц.

Наиболее выраженный антимикробный эффект в отношении всех изу­чаемых тест-культур показали препараты кислоторастворимого хитозана с молекулярной массой (ММ) 58 и 87 к Да и степенью деацетилирования 80-80,3% (см.табл. 4).

Таблица 4



Антимикробный эффект хитозана в отношении изучаемых тест-культур

Конц, %




Хитозан, ММ 87 кДа




Хитозан, ММ 58 кДа

0,025

М. avium

М. Bovis

М. fortuitum

М. intracellulare

М. avium

М. Bovis

М. fortuitum

М. intracellulare

0,0 5

+

++++

++++

++++

+

++++

++++

++++

0,075



++++

++

++



++++

++++

++++

0,1

-

+++

++

++

-

+++

++++

++++

0,2



++

++

++



++

++++

+++

0,3

-

-

+

+

-

-

++++

+

0,5

-

-

+

+

-

-

++++

+

Проведенное исследование позволило сделать вывод, что изучаемые хитозаны, обладающие свободными аминогруппами, оказывали влияние на рост микобактерий. Наличие NH2-rpynn хитозана придает полимеру положи­тельный заряд, в результате чего он способен взаимодействовать с анионны­ми группами поверхности клетки и за счет электростатических и ионных взаимодействий формировать полиэлектролитные комплексы с компонента­ми бактериальной поверхности, вызывая их гибель.

На рис. 5 показано, что при концентрации в среде 0,1% хитозана 58 кДа гибель клеток составила 40% и 50% в случае контакта клеток с хитоза-ном 87 кДа.





Гибель клеток, %

мол.масса



Рис. 5. Влияние образцов хитозана с различной ММ на гибель клеток М. avium и М. Bovis.
Низкомолекулярный кислоторастворимый хитозан с низким значением ММ обладал антибактериальной активностью по отношению к штаммам ми-кобактерий M.smegmatis и может быть использован в дальнейших исследо­ваниях для инактивации (гибели) других патогенных и непатогенных микро­организмов.
3.3. Сорбционные свойства хитозана и его применение при

выращивании молодняка сельскохозяйственных животных
Полученный активированный хитозан с высокой абсорбционной емко­стью был испытан как препарат «Энтеросорбент» вначале на лабораторных, а затем на молодняке сельскохозяйственных животных и птицы. По результа­там научно-хозяйственных опытов в хозяйствах Московской, Тульской, Брянской и Курской областей, в том числе в зонах высокого загрязнения поч­вы продуктами распада тяжелых металлов, была проведена оценка лечебного воздействия хитозана при желудочно-кишечных заболеваниях телят и поро­сят, а также его радиопротекторного действия.

Влияние препаратов хитозана на морфологический состав крови телят в условиях плотности загрязнения почв радиоцезием (Брянская область), представлены в таблице 5.

Таблица 5

Влияние применения препарата хитозана на содержание клеток крови и гемоглобина в эритроцитах у молодняка крупного рогатого скота

Группы

Эритроциты,

10.2/л

Гемоглобин, г/л

Гемоглобин в эритроци­тах, г* 109/л

Лейкоциты,

109/л

Гематокрит,

%


Перед началом опыта (п=12)




7,44±0,21

120,50±3,28

16,35±0,66

10,54±0,70




Через 63 суток использования препаратов (п=6)

1.

6,45±1,7

107,10±4,75

1б,66±0,75

10,43±2,31

34,17±0,70

2.

6,26±0,16

104,42±5,16

16,73±0,85

7,56±0,76

35,33±0,76

3.

7,28±0,54

109,00±6,24

15,34±1,37

8,02±0,88*

32,83±1,35

Через 85 суток использования препаратов при убое (п=3)

1.

7,35±0,19

138,67±17,34

18,82±2,12

7,63±1,25

37,00±2,08

2.

8,34±0,19

146,67±20,74

17,51±2,32

10,47±2,14

43,00±1,53

3.

7,22±0,79

110,33±10,41

15,88±3,11

8,70±1,28

36,67±3,71

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6 % у животных опытных групп по сравнению с контролем. Данные о влиянии скармливания хитозана и фитохитодеза (водорастворимого хитозана с экстрактом лекарственных растений) на динамику живой массы телят пред­ставлены на рисунке 6.


Живая масса




1 2 3

Возрастные группы телят

Рис.6..Динамика роста живой массы телят при скармливании хитозана и фитохитозана


Проведенные исследования показали, что повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловила ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нор­мой. Скармливание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана препятствовало развитию этих процессов, т.е. оказало радиопротекторное дей­ствие.

Высокомолекулярная фракция хитозана обладает бактериостатическим действием, пролонгирует действие растительного экстракта в составе препа­рата, связывает и выводит из организма токсины и ионы тяжелых металлов.

Олигомеры хитозана, всасываясь в кровь, быстро разносятся по всем органам и тканям, оказывая стимулирующий эффект на иммунную систему и неспе­цифические факторы резистентности организма, в первую очередь посредст­вом активации Т- и В-клеток иммунной системы. Фракции с ММ 50 Кда в ус­ловиях топкого кишечника переходят в коллоидное состояние, в котором усиливаются хелатообразующие и комплексообразующие свойства хитозана оказывают детоксицирующее действие на организм.

3.4.Антиметастатическая активность олигомеров хитозана в фитохитодезтерапии

Исследована антиметастатическая активность олигомеров хитозана. Смесь глюкозамина и его димера (~ 50%) использовалась в качестве адъюванта в комбинированной терапии с цитостатиками в низких дозах в эксперименте по изучению антиметастатической активности на L-карциноме. В опытах были использованы мыши-гибриды BDF, весом 21-22 г. Инокулум составлял (106) опухолевых клеток, вводимых подкожно (табл. 6.).

Таблица 6 Антиметастатическая активность олигомеров хитозана

Препарат

Разовая доза, мг/кг

НИМ.

Глюкозамин + димер

200

35,0

Циклофосфан

30,0

40,0

Цисплатин

1,2

2,0

Циклофосфан + цисплатин

30,0+1,2

57

(Циклофосфан + цисплатин) + (глюкозамин + димер)

(30,0+1,2)+ (200)

98

Как видно из таблицы 6, циклофосфан и цисплатин использованы в низ­ких, неэффективных дозах. Антиметастатический эффект (индекс ингибирования метастазов = ИИМ, %) в этих случаях составлял 40 и 2 %, соответст­венно, а для смеси циклофосфана с цисплатином и этих же количествах (30 + 1,2) ИИМ= 57. При добавлении олигомеров хитозана этот показатель возрас­тал до 98 %.

Антиметастатический синергизм действия возможен при сочетании оли-гомерной фракции хитозана с компонентами сложного состава экстракта противоонкологического фитосбора. Кроме этого, обнаруженный эффект может быть косвенным подтверждением наличия синергетического антиок-сидантного (и, по-видимому, поливалентного) действия экстрактов ле­карственного сырья, особенно для многокомпонентных фитосборов и при со­четании с полиэлектролитами природного происхождения.


3.5. Изучение биологической антиоксидантной активности хито­зана и его производных

Таблица 7



Антиоксидантная активность различных образцов сырья

природного происхождения


№ п/п

Величина АОЕ

Галоген

Содержание антиоксидантов

Исследуемые образцы сырья

1.

мг на 1 купон

Вг

0,024

Пектин цитрусо­вый

2.

мг на 1 купон

Вг

0,048

Хитозан

3.

мг на 1 купон

Вг

0,0001

Розвератроп

4.

мг на 1 купон

Вг

0,325

Кверцетин

В таблице 7 представлены результаты определения суммарной антиок­сидантной емкости (АОЕ) различных образцов сырья природного происхож­дения кулонометрическим титрованием, которое является методом количест­венной оценки антиоксидантных свойств различных продуктов.

Представленные выше данные свидетельствуют о значительно более высокой антиоксидантной активности хитозана по сравнению с биологически активными веществами растительного происхождения (в 2 раза выше, чем у пектина и в 266 раз, чем у розевератропа).


3.6. Ранозаживляющее свойство хитозана.
Из существующего в настоящее время широкого ассортимента полимерных покрытий на раны и ожоги, рассасывающиеся покрытия в наибольшей степени отвечают всем медико-биологическим требованиям, могут быть полезны как на ранних стадиях лечения ран и ожогов, так и на более поздних стадиях. Следовательно, разработка рассасывающихся прилипающих полимерных покрытий с различными сроками биодеструкции является в настоящее время актуальным направлением создания эфективных аппликаций на раны и ожоги.

Природный полисахарид хитозан обладает широким спектром действия. Его производные регулируют пролиферацию фибробластов и стимулируют нормальную регенерацию кожи. Болеутоляющее и антимикробное действие обусловлены уникальной способностью хитозана неспецифически взаимодействовать с болевыми рецепторами и клеточной стенкой микроорганизмов. Одной из причин эффективного влияния хитозана на заживление ран является стимулирующее воздействие на иммунную систему, т.к. его можно рассматривать как аналог липополисахаридов клеточных стенок микроорганизмов, выполняющих роль активаторов макрофагов. Существенной проблемой послеожоговых участков являются рубцы, образующиеся в местах регенерации кожи. Использование хитина и его производных позволяет значительно снизить гиперразрастание гранулляционной ткани. Известно, что производные хитина имеют структурные характеристики подобные глюкозаминам кожи и могут служить подложкой для роста кератиноцитов и фибробластов.

Начиная с 3 дня после нанесения ран ежедневно накладывали хитозановые пленки (1 опытная группа крыс), 200 мг левомиколя (2 опытная группа крыс) и физраствора (контрольная группа). Раневую поверхность оценивали планиметрически в день образования ожога, после 3,6,11 и 15 обработок препаратами.

Результаты изучения скорости выхода анестезина в водную среду из хитозановой пленки представлены на рис.7. Как видно из представленных экспериментальных данных выход анестезина происходит не сразу. За первые 2 часа выходит около 35%. Далее в течение последующих 10 часов выход постепенно снижается. Кинетика выхода носит диффузионный характер. Полученная зависимость позволяет говорить о том, что в пленке анестезин распределен совместно с хитозаном, который и пролонгирует выход.

Полученные данные позволяют полагать, что биоактивный слой покрытия с анестезином и хитозаном позволит пролонгировать анестезирующее действие раневого покрытия.





Рис. 7. Кинетика выхода анестезина из пленочного слоя хитозана

Результаты планиметрической оценки раневой поверхности при химическом и термическом ожогах представлены в таблицах 8 и 9. После 3-х кратных аппликаций хитозана и левомиколя гиперемия и отечность отсутствовали, раневая поверхность уменьшилась на 54% по сравнению с контролем (табл.8). Еще более значительные результаты были достигнуты после 6 аппликаций, а полное заживление ран и полноценное восстановление волосяного покрова наступало соответственно к 10 и 12 дню лечения. При этом образовавшаяся при регенерации ткань была очень похожа на интактную кожу. В контрольной группе полное восстановление раневой поверхности происходило только к 15 дню, волосяной покров восстанавливался не полностью.

На начальном этапе лечения химического ожога процент уменьшения раневой поверхности в группе животных, где применяли хитозановую пленку составил 8-11%, а к 11 дню лечения – 60% по сравнению с контролем. Полное заживление наступало на 15 сутки лечения, а в контроле – на 21 сутки.

Таблица 8


Динамика сокращения раневой поверхности после термического ожога




Группы

Количество аппликаций


3

6

11

Хитозан

45,73,8

17,02,7

0

Левомиколь

44,9+2,6

25,8+4,8

7,3+1,1

Контроль

96,74,5

64,1+3,8

27,0+2,1
скачать файл


следующая страница >>
Смотрите также: